抗菌靶点：琥珀酸脱氢酶、甾醇生物合成去甲基化和Qo位点的复合Ⅲ细胞色素bc1(Cytb基因)、丙酮酸激酶
蛋白三维结构、药物亲和力反应靶点稳定性技术、
菌丝生长速率法测定化合物对病原菌的体外杀菌活性
体内杀菌活性
密度泛函理论计算。
根据其抗真菌活性，在Gaussview6.0中绘制了ferimzone和高活性化合物5q。
两种结构的分子轨道计算使用高斯09W程序进行。
采用DFTB3LYP/6-31G(d)方法对高斯09W包中的两个结构进行优化，
采用DFT-B3LYP/6-31G(d, p)方法进行单点能量计算
扫描电镜观察
为了观察5q对立枯丝核菌微观结构的影响，采用扫描电子显微镜观察了立枯丝核菌的形态结构。
透射电镜(TEM)观察
观察5q对茄霉菌丝超微结构的影响
转录组分析
RNA提取
选择R. solani AG-1IA基因组作为参考基因组。
使用Goatools软件(https://github.com/ tanghaibao/ Goatools)进行GO功能分析，使用R语言脚本对基因集中的转录本进行KEGG通路富集分析。
qRT-PCR Analysis.
为了验证和分析转录组数据
采用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)对10个显著不同的表达基因进行了检测
cDNA用逆转录酶试剂盒
qRT-PCR采用Q-PCR Super Mix
表达数据用18S rRNA基因归一化，用2−△△Ct法计算相对变化。
引物序列在支持信息中列出。
用三个独立的生物重复分析转录物的积累，每次运行至少有三个性能副本。
分子对接
为了探索化合物5q可能作用的蛋白质
分子蛋白质结合能力的初步测定是使用分子对接
根据转录组和qRT-PCR分析，AGIIA_04388、AG1IA_04616和AG1IA_07770表达显著，被认为发挥了重要作用。
因此，选择这些基因进行分子对接。
从NCBI数据库中获得AG1IA_04388、AG1IA_04616和AG1IA_07770的氨基酸序列。
分别以褐家鼠、酿酒酵母S288C和铜绿假单胞菌晶体结构(PDB 1dub、6u77和6tum)为模板，
利用SWISS-MODEL构建了这些蛋白的三维结构
结合袋由已知底物在蛋白质晶体结构中的结合位置确定。
在ChemBioDraw Ultra 12.0中绘制分子结构，并使用3D MM2程序使分子能量最小化。
使用YASARA程序进行受体与配体的对接分析。
对接模式通过Pymol和Discovery Studio软件显示。
以植物致病真菌品种:番茄枯萎病菌(Alternaria solani)、葡萄泡孢菌(Physalospora piricola)、油菜枯萎病菌(Alternaria brassicae)、弯孢菌(Curvularia lunata)、炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、稻瘟病菌(pyracaria oryza)、bulbigenum镰刀菌(Fusarium bulbigenum)、枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. niveum)和番茄枯萎病菌(Fusarium solani)为试验真菌。
抑菌活性
采用菌丝体线性生长速率法测定了化合物对植物病原真菌的抑菌活性
目标化合物(13 mg)溶于0.5 mL DMSO中，用9.5 mL去离子水稀释。
将得到的溶液加入熔融的PDA介质(250毫升)中，充分混合，然后倒入消毒的培养皿中。
化合物在PDA培养基中的最终浓度为50 μg/mL。
同样的不含该化合物的处理被用作空白对照。
在同样的条件下，以商用抗真菌药物噻苯咪唑和唑氧菌酯作为阳性对照。
将病原真菌菌丝盘(5mm)接种于含有50或20 μg/mL目标化合物的PDA培养基中心，在28℃、80%湿度的黑暗条件下孵育。
每个处理设置为三个平行试验。
培养后，用交叉支架法测定菌落直径(mm)。
生长抑制率按下式计算，用均数±标准差表示。
生长抑制率(%)= [(c s)/(c 5)] × 100%，其中dc和ds分别为空白对照和处理菌落的平均直径。
与上述方法相似，采用双倍稀释法分别在50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625和0.78125 μg/mL浓度下测定中位有效浓度(EC50)。
所有试验均处理3个重复。用Prism 7软件(GraphPad)计算EC50值、95%置信区间(95% CI)、回归方程和R2
体内抗真菌活性测定
将大小相同、形状规则的苹果随机分为六组。
将苹果在1%次氯酸钠溶液中浸泡2分钟，然后用清水冲洗5分钟，以去除次氯酸钠残留。
用75%酒精擦拭苹果表面，在无菌条件下自然干燥后，在苹果赤道处钻孔，直径5毫米，深度3毫米。
待孔干燥后，在每个孔中加入50 μL不同浓度(200、100、50、25 μg/mL)的化合物13丙酮溶液。
待孔中的丙酮自然蒸发干燥后，将传代培养基中直径5毫米的皮孢霉菌丝盘放入孔中。
将苹果放在25°C和80%湿度的培养箱中7天。
空白对照为丙酮，阴性对照为蒸馏水。每个处理重复3次
菌丝形态及细胞超微结构分析
以化合物1为母体化合物，以P. piricola为供试菌。
将皮孢霉菌丝盘(5mm)接种于15.0 μg/mL (EC80)无1或加1的PDA平板上。
培养基在28°C、80%湿度下暗处培养5 d。
扫描电镜分析
菌落周围切下的菌丝块(5.0 mm × 4.0 mm)
用4%戊二醛在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中处理24 h，温度4℃。
用相同的缓冲液洗涤四次后，用一系列分级乙醇(10、30、50、70、80和90%，v/v)脱水15分钟。
最后，用100%乙醇清洗三次，每次30分钟。
随后，在一个临界点干燥这些块，并镀金
采用Nova Nano SEM450扫描电子显微镜在10 kV加速电压下进行扫描电镜观察
注：戊二醛是一种常用的交联剂，可以在生物学、生化学和免疫学等领域中使用。在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中处理24小时后，4%戊二醛可以用于固定细胞或组织样本。
这种处理方式通常被称为“固定”，它有助于保持细胞或组织的形态和结构，并防止其腐败或分解。此外，戊二醛还能够使某些蛋白质之间发生交联反应，从而增加它们的稳定性并减少其易受到降解作用的可能性。
需要注意的是，在使用戊二醛进行固定时必须小心谨慎，因为过度固定会导致样品变得不透明且难以穿透。此外，在固定前最好将样品放置在低温下（如4℃）以减少任何可能影响结果的代谢活动。
透射电镜分析
从菌落外围切下的菌丝，用4%戊二醛在0.1 M磷酸盐缓冲液(pH 7.2)中固定24 h，温度4℃。
随后，将菌丝在磷酸盐缓冲液中冲洗4次，每次15 min。
接下来，用不同浓度的乙醇(30,50,70,80,90，和100%，v/v)对菌丝进行两次脱水，每次10分钟，
然后依次用不同浓度的White ‘s树脂渗透。
最后，将菌丝用100% White ‘s树脂浸润，埋入干胶囊中，在60℃下聚合2天以上，切成薄片。
用醋酸铀酰和柠檬酸铅对菌丝进行双染色，在80 kV Tecnai G2 Spirit BioTWIN透射电镜下观察。
注：醋酸铀酰染色和柠檬酸铅染色是电子显微镜中常用的两种负反应染色方法。
1.醋酸铀酰（Uranyl Acetate）染色：这种方法使用一种含有氧化铀离子的溶液来对样品进行处理，使其在电子显微镜下呈现出明亮的负影像。由于氧化铀离子可以与生物分子中的磷、羧基等结构发生相互作用，因此该方法特别适合观察细胞核、线粒体、内质网等细胞器以及DNA或RNA等大分子结构。但需要注意的是，过度使用或浓度太高会导致伪影或损坏样品。
2.柠檬酸铅（Lead Citrate）染色：这种方法则利用了金属离子与组织成份间不同程度复杂形成沉淀而产生阴性效果。它通常被用于固定后切片标本上，并且能够显示出蛋白质和其他有机分子结构。但也需要注意到，如果操作不当可能会造成毒性危险，在使用时必须小心谨慎。
总体来说，这些反应都是为了增强样品在电镜下可见性而采取的措施。选择哪一种方式取决于具体实验目标和所要观察的对象类型及其特点
安全评估。
安全性评估包括化合物对植物种子萌发和植物幼苗生长的影响。
种子萌发试验。
实验材料为神州八号种子
选择母化合物1和活性较强的化合物13作为测试化合物。
将化合物溶解在DMSO中，用0.5% DMSO (v/v)稀释成一系列浓度(200、100、50和25 μg/mL)的测试溶液，
采用双倍稀释法。将0.5% DMSO水溶液作为空白对照。
每个处理使用15粒籽粒饱满、大小相近的种子。
种子在试验溶液中浸泡12 h后，用滤纸吸干所有种子，放入培养皿中，25℃，80%湿度，暗处孵育。
我们保持了适量的水分，以确保种子在培养皿中萌发。
通过比较对照组和处理组的发芽率和萌发状态，评价化合物对种子萌发的影响。
植物幼苗生长试验如下。
试验材料为西北农林科技大学种子中心提供的小麦种子。
选择均匀饱满的种子发芽，7天大的小麦幼苗用于后期试验。
以浓度为0.5% DMSO (v/v)的水中溶液1和13(100、50、25和12.5 μg/mL)为测试溶液。
用0.5% DMSO水溶液作为空白对照。
每种处理随机选择5株幼苗，放在一个小瓶中用不同浓度的测试溶液。
所有实验均重复进行三次。
在试验过程中分别于3、12、24、48 h观察小麦幼苗的生长状况。
通过比较对照组和处理组小麦幼苗的生长状况，评价化合物对幼苗生长的影响。
体外SDH酶测定。
选择化合物13作为测试化合物。
Boscalid作为阳性对照;一种常见的SDHI。以P. piricola为供试菌。
使用SDH测定试剂盒(Solarbio, BC0950)检测SDH酶活性。
在离心管中收集正常培养的皮孢霉菌丝。
用试剂盒中的试剂1和试剂2处理后，将菌丝在冰浴条件下充分研磨，4℃，11000g离心10 min。
使用含有SDH酶的上清液，按照试剂盒中描述的操作程序测定13和boscalid的SDH抑制活性。
用Prism 7软件计算中位抑制浓度(IC50)值和95%可信区间(95% CI)。
分子对接分析。
SDH的三维晶体结构(PDB代码:2FBW)从RCSB Protein Data Bank下载。
分子对接过程使用Discovery Studio 2016 软件进行
果实侵染模型的体内评价
将健康的梨仔细清洗，用清水、75%乙醇和无菌水分别消毒两次。
用无菌钻孔机打孔，将真菌溶液(含化合物10的0、64、128 μg/mL)接种到无菌孔中。
阳性对照为Boscalid （啶酰菌胺）(100 μg/mL)。
每个梨在接种后第0、5、7天进行观察。
动物感染模型的体内评价
由于Galleria该适用于大样本研究，且具有与哺乳动物相似的先天免疫功能，因此选择mellonella幼虫作为动物感染模型，评估其体内抗真菌活性。
注：G. mellonella是什么
G. mellonella是一种小型蛾类昆虫，也称为蜡蛾。
它们通常生活在欧洲、亚洲和北非的森林中，但现在已被广泛用于实验室研究中。
由于其相对较大的体积和易于饲养的特点，G. mellonella成为了许多微生物学家和免疫学家进行感染性疾病模型实验的理想选择之一。
选择45只体型适中、活力高、体重相近的大蜡螟幼虫作为实验对象，
每组平均15只，分为FLC组、复方10组和空白组。
每只幼虫分别用2 μg FLC（氟康唑）、4 μg化合物10或等量PBS处理。
采集白色念珠菌野生型菌株SC5314隔夜液体培养液，PBS冲洗3次，避免培养基对幼虫的影响。
（可能是离心后加PBS吹打反复3次）
PBS调整真菌浓度至5 × 107 cells/mL，每个幼虫左前肢注射10 μL。
2 h后，将10 μL FLC (2 μg)、化合物10 (4 μg)或PBS分别注入幼虫右足。
所有幼虫在37℃、适当湿度和避光条件下培养。