1、葡聚糖凝胶简介
1.1 葡聚糖凝胶的分类
(1)交联葡聚糖凝胶(Sephadex)
SephadexG：G后的数字为凝胶吸水值的10倍。
例如：G-25为每克凝胶干胶溶胀后吸水2.5克
G反应凝胶的交联程度、膨胀程度和分离范围。
交联度越高，凝胶孔径越小。 不会不会不会不会不会不会不会不会
(2)琼脂糖凝胶(Sepharose，pharmacia，Bio-Gel，BIo-Rad)
依靠糖链之间的次级键维持网状结构
琼脂糖密度越大，网状结构越密集。
(3)聚丙烯酞胺
一种人工合成的凝胶，以丙烯酞胺为单位，由甲叉双丙烯酞胺交联而成。
交联剂越多，孔隙度越小。
商品名为生物胶-P (Bio-Gel P)
(4)聚丙乙烯凝胶(Styrogel)
大网孔结构
1.2 LH-20简介
Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用
Sephadex G-25羟丙化后就是Sephadex LH-20
Sephadex LH-20是最常用的葡聚糖凝胶
Sephadex LH-20优点
分离性能好，可再生利用、上柱样品损失少，有利于分离少量样品
Sephadex LH-20缺点
贵！！！
1.3 LH-20的分离原理
分子筛原理（过滤作用）：大分子化合物先被洗脱，小分子化合物后被洗脱。
反相分配作用（在反相溶剂中）：极性大的先被洗脱，极性小的后被洗脱。
注：在反相溶剂中，与反相溶剂相比，凝胶极性较小。
注：分子筛原理：凝胶颗粒内部具有多孔网状结构，被分离的混合物流过层析柱时，比凝胶孔径大的分子不能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之间的空隙向下移动，并最先被洗脱出来;比网孔小的分子能不同程度的自由出入凝胶孔内外，在柱内经过的路程较长移动速度较慢，最后被洗脱出来。
注：如果使用正相溶剂洗脱，则主要靠分子筛作用来分离。
1.4 洗脱溶剂
分为两类：反相和正相两种
反相溶剂洗脱，以甲醇－水系统最为常见，先用水，逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
正相系统洗脱，以氯仿－甲醇最为常见，先用氯仿－甲醇（1：1），逐渐增加甲醇比例，最后用100％甲醇冲柱。
注：多采用反相溶剂系统。
1.5 样品的处理和洗脱溶剂的选择。
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－水）
样品用最少体积的甲醇－水（尽可能甲醇少一些）溶解，过滤后，湿法上样。
如果样品极性小，选用正相溶剂洗脱（氯仿－甲醇）
样品用最少体积的氯仿－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
注意：湿法上样前样品一定要过滤！！！如果把Sephadex LH20堵了，就得将Sephadex LH20 的柱头部分弃去，太心痛了！！！
2 LH20柱色谱分离化合物的步骤
2.1 选择洗脱条件
梯度洗脱在凝胶柱色谱中使用中并不像在正相柱层析中那么重要
一般不进行梯度洗脱
除了洗柱冲柱的时候要换洗脱剂
原因：
LH20在不同的溶剂中的吸涨程度不同
改变流动相的极性，会改变LH20的膨胀率
分子量不同的物质在网孔改变过程中引起交错，反而达不到分离效果。
样品要能溶解在尽量少量的洗脱剂中
极性大的用甲醇水系统
极性小的一般用不含水的系统
常用的有：
正己烷——二氯甲烷——甲醇系统
二氯甲烷——甲醇
注意：切不可使用纯氯仿作为洗脱剂，氯仿比重大，填料将上浮，严重影响分离效果。
2.2 溶胀凝胶
注：如果已经有装好的凝胶柱，则可以跳过此步骤。
LH20在使用前必须进行溶胀
室温下，将凝胶浸泡在层析液（通常为甲醇）中至少三小时
溶胀后胶沉淀体积占总体积的75%，上层溶剂占25%
目的：使凝胶悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动
注意：
溶胀后太稠会导致在后续搅拌时产生气泡
太稀会延长装柱的沉降时间，增加添加凝胶悬浮液的次数
注意：
在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒
要避免使用磁力搅拌器
2.3 装柱
先在柱底活塞处塞一小块棉花，阻止硅胶流出
在柱中加入1/4柱高的洗脱剂
打开活塞，排出柱下端空气
用洗脱剂将凝胶摇匀
迅速倒入柱内（可用漏斗辅助）
直立柱身，让其自然沉降
注意：装柱过程中保持活塞打开
装柱完成后打开活塞至少半小时，流出几个柱体积的洗脱剂
目的：使凝胶膨胀在正确比例的洗脱剂中
2.4 柱平衡
注：如使用与柱中相同的溶剂，则可以省略柱平衡
上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积
如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质
凝胶在不同溶剂中溶胀程度不同，差距过大会产生气泡
例如：
如果使用20%甲醇-水，改成氯仿-甲醇1：1
则先将其置换为甲醇，再置换成氯仿-甲醇
2.5 样品处理
用尽量少的洗脱剂溶解样品，常压下经过0.45um的膜过滤
注意：样品体积应该占柱总体积的1-2%
要求：
1、样品一定要完全溶解且过滤（样品不溶解容易造成脱尾）
2、溶解样品的体积尽可能小（减小原始谱带宽度）
3、样品的溶解最好与洗脱的起使浓度相同
原因：
溶解溶剂浓度洗脱能力大于洗脱起使溶剂，洗脱起使溶剂的洗脱能力增加，分离效果降低。
若溶解溶剂与洗脱的起使溶剂差别很大，样品可能因溶解性的问题而析出。
以上三点是上样的基本要求，有时很难求全。
一般满足1，2点，尽可能满足第3点
如果样品极性大，选用反相溶剂洗脱（甲醇－水）
样品用最少体积的甲醇－水（尽可能甲醇少一些）溶解。
如果样品极性小，选用正相溶剂洗脱（氯仿－甲醇）
样品用最少体积的氯仿－甲醇溶解，过滤后，湿法上样。
请注意：“尽可能”，实在不行就算了。
2.6 湿法上样
关闭活塞
用滴管垂直伸到柱床上1cm处，将样品绕柱内壁加入，使样品溶液均匀分布
打开活塞
用洗脱剂冲洗壁上残留的样品。
注意：
LH20上样体积没有明确的规定，一般在柱床体积的1／10。
2.7 洗脱
控制流速，一般每秒1滴以下（1drop/s），
可参见厂家的一些参数;必要时更改极性（很多时一个极性就可以将样品洗脱完毕）。
再生以备下次使用。
注意：所有洗脱液应经过0.45um的膜过滤以除去杂质
2.8 冲柱
使用100％甲醇作为流动相，冲洗2-3个柱体积
3 分离的技巧
（1） 流速不可太快，切切不可心急，所谓欲速则不达。
（2） 柱子尽可能长， Sephadex LH20 柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。
（3） 馏分一定要接的细，可1／10，或1／20 个保留体积接成一馏分。
（4） 洗脱体积一般为2-3个保留体积，对特殊保留强的化合物，可洗脱5个保留体积。
（5） 鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。
（6） Sephadex LH20 对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
（7）如果要分离的样品中极性相差较大，可以细分为不同的极性段再上Sephadex LH-20
4 常见问题及解决方法
4.1 吸涨程度
Sephadex LH20在不同的溶剂中的吸涨程度不同
任何填料在不同的溶剂中的吸涨程度都是不同的,只是Sephadex LH20很明显
一般不用丙酮，乙酸乙酯作溶剂（LH20在丙酮，乙酸乙酯中收缩很厉害）
如果前后使用的两种洗脱溶剂对Sephadex LH20的吸涨程度相差很大,还会产生大量气泡
注：以下列举了1g干态Sephadex LH20对不同溶剂的保留体积：
water 2.1ml
MeOH 1.9ml
EtOH 1.8ml
CHCl3 1.6ml
n-BuOH 1.6ml
丙酮 0.8ml
乙酸乙酯 0.4ml
甲苯 0.2ml
4.2 样品量很大
在分离过程中遇到要分离的样品量很大,而柱层填料相对较少的情况是很多的
一般解决的途径有两条:
1、一次上样
将样品一次全上柱
缺点：分离效果差
但可以将样品交叠的部分再上一遍或几遍，即反复xxx柱层析
优点：工作量小
2、分次上样
将样品分几次分别分离
优点：每次分离的效果好
缺点：
每次上样柱层的条件会发生改变，分离的重现性不好
如果在馏分合并的过程中合的太粗，则总体分离效果变差。
合的太粗：指过多的馏分合到一起
推荐的做法
将样品一次全上柱，再通过反复柱层析的方法来逐步提高分离效果
如果实在太多，就只好分开上柱了
4.3 分离效果很差
如果使用Sephadex LH20的分离效果很差分离效果很差，则说明样品的分子大小差距较小
如果仍然使用Sephadex LH20分离，推荐利用其反相分配原理，使用甲醇-水体系进行梯度洗脱（初始甲醇浓度低）
4.4 溶剂难蒸干
像水这种高沸点的溶剂是很难蒸干的，办法是有的
1、提高真空度
真空度由水泵的效率和系统的密闭性决定
一般的国产水泵就能满足日常的需要(包括蒸水)
但一定注意的是水泵的循环水一定要开
如果不开循环水,水泵中的水很快就会变得很热
真空度将明显下降，将极大地减少水泵的效率
且会将抽出的溶剂挥散出来,很不好
比国产水泵更好的是进口水泵
比进口水泵更好的是隔膜泵
特别是蒸像水、丁醇这样的溶剂,对系统的密闭性的要求很高
对于系统密闭性不好时,可采用逐步拆分法来查漏,最容易出问题的地方在垫圈
国产旋蒸配的垫圈很差,不耐氯仿等有机溶剂
当用国产的旋蒸过氯仿等有机溶剂时垫圈就废了
所以要多预备几个垫圈
2、提高蒸发温度
提高蒸发温度当然可以提高蒸发的效率,但可能发生物质的变化,
国产旋蒸+水泵+水冷循环液=只能提高蒸发温度
另外：向要蒸的水溶液中加甲醇,使甲醇占到30%,蒸出速度将大大提高!
4.5 LH20柱子脏了
原因：
大多数情况下是由于样品没过滤, 将柱头堵住
或由于样品的死吸附(一般很少发生),使柱子的柱头部分污染
处理：将被污染的柱头部分的填料弃去
操作方法：只将被污染的柱头部分的填料用滴管轻轻搅起并吸出，倒掉即可
柱子整个被污染：
如果是将Sephadex LH20用反相系统洗脱时被污染，办法如下
依次用水、NaOH-NaCl水溶液、水、甲醇洗涤被污染的柱子。
因为是整个柱子被污染，所以污染物一定不会完全死吸附在柱上
如果完全死吸附在柱上，污染物一定会只在柱头部分
所以用合适的溶剂一定可以将其洗下来。
NaOH-NaCl水溶液配法：
8g NaOH
30g NaCl
1000ml水