0 引物设计
在进行RT-PCR之前，需要设计拟分析基因的引物。
详情可参考：RT-PCR完全攻略
1 试剂和材料
DEPC水 探索平台 Adamas G8010-500mL
DEPC 碧云天 10g ST036
无菌无酶枪头：
赛维尔 盒装吸头 10μL加长（第二代低吸附，无菌无酶）T-10PL-C
赛维尔 盒装吸头 200μL（第二代低吸附，无菌无酶）T-200L-C
赛维尔 盒装吸头 1000μL加长（第二代低吸附，无菌无酶）T-1000L-C
6孔板：赛维尔 细胞培养板（6孔板，TC处理，单片装）CCP-6H
氯仿:赛维尔 氯仿替代物(核酸抽提辅助试剂）25ml G3014-01
异丙醇 西陇科学 HPLC500ml 货号：1280250801600
无水乙醇
总RNA提取试剂：赛维尔 RNA提取液 G3013-100ML
逆转录试剂盒：Adamas life 5× Reverse Transcription Mix(with gDNA Remover)（货号：G8040-0100）
PRC试剂盒：赛维尔2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix 5ml 380元
赛维尔荧光定量PCR封板膜（高粘性） G6067-100 100张 200元
赛维尔PCR 8联管 PCR-0801-FC 125条 150元
赛维尔PCR反应板（透明）PCR-9601-NS 10个/盒/70元
荧光染料 探索平台 Adamas life 染料法彩色荧光定量PCR预混液 (预混高浓度ROX, 抗体法) G8048-1
gapdh 生工
SDS-PAGE 赛 凝胶快速制备试剂盒 G2037-50T ￥100
2 实验用品处理
2.1 塑料制品
先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中
然后将塑料制品逐个浸泡其中
其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用
实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次
2.2 玻璃制品
泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）
(洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干）
2.3 匀浆器
（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC)
2.4 试剂配制：
1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水,放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。
2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存(其中DEPC水需先高压）
3、异丙醇：放入棕色瓶中
4、氯仿：放入棕色瓶中
5、琼脂糖
3 细胞或组织样本裂解
3.1 组织
组织样本：
组织剪切成小块（黄豆大小），放入预冷的匀浆器内
每100 mg组织加入1 mL RNA提取液，匀浆至无可见组织块。
（可选步骤：4℃，12000 g离心10 min使组织碎片分离，转移上清至新的离心管中。）
血液样本：
新鲜血液样本每200 μL加入800 μL RNA提取液，移液枪反复吹打混匀，室温静置5-10 min；
如果是组织RNA稳定保存液（塞维尔，G3019）保存的血液样本，先经4000-5000 rpm离心5 min，弃上层组织RNA稳定保存液，再加入800 μL RNA提取液，移液枪反复吹打混匀，室温静置5-10 min。
3.2 细胞
贴壁细胞：
去除细胞培养液，用适量预冷PBS清洗细胞，尽量将PBS吸除干净。
按照6孔板每孔加1 mL RNA提取液，12孔板每孔加0.5 mL RNA提取液的用量向孔板中加入RNA提取液，轻轻晃动使板底细胞充分接触RNA提取液
移液枪吹打细胞，使细胞裂解，然后转移至离心管中，室温静置5 min。
悬浮细胞：
离心收集细胞，尽量将上清液吸除干净，每1-10×106个细胞加入1 mLRNA提取液，移液枪吹打数次使细胞裂解，室温静置5 min。
GAPDH的mRNA水平被用来对感兴趣的基因表达进行归一化。（GAPDH就是内参）
引物序列 gene Sequence (5′ to 3′)
TNF-α TCTACTCCCAGGTCCTCTTCAAG, GGAAGACCCCTCCCAGATAGA
IL-6 GCCACTCACCTCTTCAGAACGA, TCACCAGGCAAGTCTCCTCATT
GAPDH GGAAGCTTGTCATCAATGGAAATC, TGATGACCCTTTTGGCTCCC
TIMP1 gcttctggcatcctgttgttg acgctggtataaggtggtctg
TIMP2 ggtcagtgagaaggaagtggac gggggccgtgtagataaactc
TIMP3 gccttctgcaactccgacatc cagcttaaggccacagagactc
HPRT1 gaccagtcaacaggggacat gcttgcgaccttgaccatct
4 总RNA提取
每1 mL RNA提取液加200 μL氯仿，涡旋混匀或离心管上下颠倒剧烈晃动15 s，室温静置3-5 min。
4℃，12000 g离心15 min，
小心转移上层无色水相至新的离心管中，每毫升提取液大约可吸取500-550 μL。
沉淀RNA：向上述收集的水相提取物管中加入500 μL异丙醇，轻轻颠倒混匀数次，室温或4℃沉淀10min（或-20℃沉淀15min）。
离心：4℃，12000 g离心10 min，在管底可见白色沉淀即为总RNA，弃上清。
洗涤：加入1 mL 75%乙醇，颠倒混匀（至白色沉淀漂浮为佳）。4℃，12000 g离心5 min，弃上清，再高速短暂离心（5000 g离心3-5 s），用微量吸头小心吸尽液体。
RNA溶解：将有RNA沉淀的离心管开口静置3-5 min，使RNA稍微晾干，然后加入20-50 μL DEPC水或无RNase水（或者使用RNA溶解液G3029、G3030）使RNA充分溶解，即可用于浓度检测及后续实验，不能及时进行后续实验时需将RNA置于-70℃保存。
注意不可让RNA过分干燥，否则很难溶解，且会影响A260/280比值。
RNA浓度测定
清洗RNA浓度测定仪，设置仪器参数
使用DEPC水对仪器进行调零
滴加1ul RNA溶液到仪器中开始测定RNA浓度（ng/ul）、A260/280及A260/230比值
注意：每次测量前需将仪器擦干
注：正常的比值范围为
A260/280=1.02.02.2
A260/230=2.0
5 逆转录合成cDNA第一链
根据反转录试剂盒确定反转录体系，再根据确定的体系换算各样品和补加的无酶水应取的体积
冰上配制反应体系，混匀后快速离心一次，放入PCR仪中进行反应。
反应条件如下：
37℃，30分钟（反转录反应）
85℃，1分钟（使反转录酶失活）
4℃， 不限时（可随时取出产物）
产物-20℃冰箱冻存
注：反转录使用随机引物即可
注：若直接做qRT-PCR，建议用Oligo dT（引物）
注：使用特异性引物的场合
1、不需要其他基因，只要目的基因
2、目的基因表达过低
3、目的基因过短（比如microRNA,只有几十BP）（PCR要求100BP以上）（特异性引物会补足目的基因至100BP左右）
4、如果后续做qPCR，则应先将总RNA中的DNA（基因组DNA）去掉（可选用带有DNA清除剂的试剂盒）
注：逆转录前建议做65℃ 5min的热变性，可以使RNA充分打开，促进反转录引物的结合。
6 qRT-PCR反应
试剂盒：(品牌：TaKaRa)Premix Taq(TaKaRa Version2.0 plus dye)
(货号：RR901A)
该试剂盒反应液配制
Premix Taq 10ul
模版 Xul
引物1（10uM） 0.4ul
引物2（10uM） 0.4ul
灭菌蒸馏水 9.2-Xul
共计20ul
特点：
2X mixture 含酶、buffer、dNTP、Mg2+，使用方便
已含染料，跑完PCR后再跑电泳不需要再加loading buffer
冷启动（要在冰上配制反应液）
注：若已经明确目的基因容易扩增，可使用此款试剂盒，若不明确，建议使用更好的试剂盒
注：更好的试剂盒有
(品牌：TaKaRa)TaKaRa Ex Taq DNA Polymerase (货号：RR001Q) （冷启动）
(品牌：TaKaRa)TaKaRa Ex Taq Hot Start Version (货号：RR006Q)（热启动，特异性好）
混匀快速离心一次
反应条件如下
94℃ 30sec 1 Cycle
94℃ 30sec 丨
55-65℃ 30sec 丨25-35 Cycle
72℃ xsec (1min/kb) 丨
72℃ 5-10min 1 Cycle
降温到20℃收产物
PCR产物 —20℃冰箱保存
注：退火温度可根据TM值设定，TM值减5℃即为退火温度
注：目标产物一般在400bp以内，延伸时间可用24秒
取PCR产物8μl
加5×Loading Buffer 2μl
1.2%琼脂糖凝胶电泳120V。
（100ml 1xTAE溶液溶解1.2g琼脂糖粉末于锥形瓶，放入微波炉，高火2min，停2min，再高火1min，等不烫又不凝固，迅速加入5ulEB，摇匀倒入制胶盘即可）
注:EB有毒，加的时候屏住呼吸
注：不要太热的时候加EB，不然会马上蒸发掉
注：可多制些胶，保鲜膜包裹，4℃保存
100mA 30min
溴化乙锭染色
凝胶成象仪成象并保存结果。
注:可用手提紫外灯观察电泳条带位置
注：电泳时一定要加maker，如果出现非特异性扩增，可以进行判断
注：拖尾状条带出现的原因（1、Mg2+加多了，酶过度激活2、电泳液不新鲜了）
注：引物二聚体出现的原因（1、引物设计的不好2、PCR条件设置不对）
50x TAE Buffer(Ph8.5)配方
Tris 242g
Na2EDTA·2H2O 37.2g
ddH2O 800ml
醋酸 57.1ml
共计1L