材料
细胞：RAW、BV2
试剂：CCK-8、高糖DMEM培养基、0.25%胰酶、PBS、胎牛血清、LPS、二甲基亚砜(DMSO)、双抗（青霉素和链霉素）、Griess 试剂盒（检测NO）、
仪器：
炎症目标物：
诱导型一氧化氮合成酶(INOS)
环氧合酶2(COX2)、
白细胞介素-1β(IL-1β)
**白细胞介素-6(interleukin-6，IL6) **
肿瘤坏死因子α（TNF-α）
核转录因子-κB(NF-κB)
qPT-PCR
总RNA提取试剂盒、逆转录试剂、SYBR Green染料、DEPC水、八连管、无菌无酶包装枪头
操作步骤
1、样品处理：
首先，从待测样品（如细胞或组织）中提取总RNA。
可以使用商业化的RNA提取试剂盒来完成这一步骤。
2、RNA逆转录：
将提取的总RNA逆转录为cDNA。
这可以通过使用逆转录酶和随机引物来实现。
3、实时荧光PCR反应准备：
准备PCR反应体系，包括：
引物（专门设计用于待测基因的引物）
荧光探针（如TaqMan探针）
PCR Master Mix（包括DNA聚合酶、核苷酸和缓冲液等）。
4、PCR反应：
将逆转录的cDNA加入PCR反应体系中，并在实时PCR仪中进行PCR反应。
反应条件包括一系列的温度循环，如变性、退火和延伸。
5、荧光信号检测：
实时PCR仪会在每个温度循环后检测PCR产物的荧光信号。
这些荧光信号与PCR产物的数量成正比。
6、数据分析：
使用实时PCR仪的软件分析荧光信号数据，并计算出待测基因的mRNA表达水平。
这通常是通过与标准曲线或内部参考基因的相对表达量进行比较来完成的。
INOS、COX2、IL1β 和 IL6
NF-κB 信号通路（RELB、NFKB2、NFK-BIA、IKBKE 和 TNFAIP3 ）
蛋白质免疫印迹 (Western-blotting) 分析
NF-κB 信号通路蛋白（ pIKKα、IKKα、pIκBα、IκBα）
肿瘤坏死因子α（ TNF-α）
造模剂：
干扰素-γ(interferon-gamma，IFN-γ)
脂多糖 (lipopolysaccharides，LPS)
实验流程
1、对样品做CCK-8的RAW、皮肤细胞毒检测，得到出现细胞毒性的样品浓度
检测mRNA确定出现显著活性的给药浓度
2、确定给药高中低的浓度
3、方向：抗炎、凋亡为主另有抗氧化（使用试剂盒）
4、抗炎LPS RAW、皮肤细胞，确定LPS毒性范围
5、确定LPS RAW、皮肤细胞炎症模型建立
6、测炎症指标及凋亡指标（ROS\TNF-a、IL-1B、IL-6\IL-18\IL-8\NO\）凋亡使用试剂盒检测（或者流式细胞术）（凋亡、焦亡、铜铁死亡