塞维尔BCA
原理（双缩脲反应）
目前最常用的蛋白浓度定量检测方法有两种，即Bradford法和BCA法。
BCA法定量检测蛋白的基本原理是基于双缩脲反应
即在碱性条件下，Cu2+被蛋白质还原成Cu+，
随后Cu+与BCA（Bicinchonic acid，一种显色剂）发生螯合反应，
每两分子BCA螯合一个Cu+，生成紫色的水溶性复合物
该物质在562 nm处有最高吸收值，且颜色深浅与蛋白质浓度一定范围内成正比
因此可用于蛋白质的定量检测
蛋白浓度在50-2000 μg/mL浓度范围内有较好的线性关系。
优点
本方法不受绝大部分样品中化学物质的影响
可以兼容样品中高浓度的去垢剂，
包括浓度高达5%的SDS、5%的Triton X-100、5%的Tween-20、60、80等。
缺点
螯合剂和高浓度还原剂会影响检测结果
需确保样品中无EGTA、EDTA浓度低于10 mM、DTT低于1 mM、β-巯基乙醇低于1 mM。
如样品中含有螯合剂或还原剂，可考虑Bradford法蛋白定量检测试剂盒。
试剂盒组成
BCA试剂、硫酸铜溶液、蛋白标准品（BSA）、蛋白标准配制液
操作步骤
1.配制蛋白标准贮备液：
取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）蛋白标准管中，将25 mg蛋白标准品完全溶解
即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。
配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。
2.配制蛋白标准工作液：
取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。
注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。
3.绘制标准曲线（酶标仪法）：
将蛋白标准工作液分别按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板中，
然后用PBS或生理盐水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。
得到蛋白浓度依次为0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲线。
4.准备待测样品：
将待测的蛋白样品进行适当稀释
（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），
按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。
注意：待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。
5.配制BCA显色工作液：
将BCA试剂与硫酸铜溶液按照50:1体积比充分混合均匀，得到BCA显色工作液。
BCA显色工作液可室温保存，24 h内使用。
每个待测样品需200 μL，建议按需配制，避免浪费。
6.检测：
向标准曲线样品孔及待测样品孔中每孔加入BCA显色工作液200 μL
充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s）
37℃反应30 min
以标准曲线0号做参比，在562 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。
注：也可以在室温反应2 h，或60℃反应30min。
如果蛋白浓度较低，建议置于60℃反应
7.计算：
以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。
根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。
注意事项
1.BCA法测定蛋白浓度受温度和时间的影响较大，
吸光度值会随着时间的延长或温度升高而变化，
如果不能精确控制显色反应的时间和温度，建议每次测定都需要做标准曲线。
2.在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。
稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。
3.为保证蛋白的精确定量，样品的提取和蛋白标准品的稀释配制最好选用相同的缓冲液，同保证两者检测条件一致。
如果缓冲液本身就有较高的背景值，建议使用其他的方法测定。