1、聚酰胺柱色谱简介
1.1 聚酰胺
聚酰胺(Polyamide)：是通过酰胺基聚合而成的一类高分子化合物
聚酰胺不溶于水、甲醇、乙醇、乙醚、氯仿及丙酮等有机溶剂
对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差
可溶于浓盐酸、冰醋酸及甲酸
分子量：14000～17000
比表面：5～10m2/g
PH值: 6~7
1.2 分离原理
1.2.1 氢键吸附原理：
聚酰胺酰胺基可与羟基酚类、酸类、醌类、硝基等化合物以氢键形成结合而被吸附 其脂肪长链可作为分配层析的载体
1.2.2双重层析理论：
当用极性流动相(含水溶剂系统)洗脱时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，
当用有机溶剂洗脱时，聚酰胺作为极性固定相，其层析行为类似正相分配层析。
但固定相(吸附剂)的极性是由其本身结构及性质决定的，不应随洗脱液的改变而改变，
况且聚酰胺层析属于吸附层析，不是分配层析。
因此，“双重层析理论”也没有揭示出产生这两种相反现象的根本原因。
1.2.3 洗脱机理
聚酰胺分子中有极性酰胺基团和非极性的脂肪键。
作为一个相对弱极性的化合物，当移动相为极性强的溶剂(如水、乙醇、丙酮等)时，聚酰胺作为非极性固定相，其层析行为类似反相分配层析，极性较大的吸附物易被洗脱。随着洗脱剂极性降低，极性较小的化合物可相继被洗脱下来。
1.3 吸附规律
形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。
分子中芳香化程度越高，则吸附性越强；反之，则减弱。
易形成分子内氢键者在聚酰胺上的吸附相应减弱。
聚酰胺与物质的氢键缔合能力在水中最强
在含水醇中则随着醇浓度的增高而相应减弱
即随着醇浓度提高，样品越容易被洗脱下来
在高浓度醇或其它有机溶剂中则几乎不缔合
强酸或强碱均可破坏聚酰胺与溶质之间的氢键缔合
1.4 应用范围
特别适应于多元酚类化合物的分离，如黄酮、醌类、酚酸、含羰基化合物、羧基化合物等。
对鞣质吸附强，用于将植物粗提物中的鞣质除去。
2、新聚酰胺的前处理
取聚酰胺以90-95%乙醇浸泡，不断搅拌
除去气泡后装入柱中。
用3-4倍体积的90-95%乙醇洗脱
洗至洗脱液透明并在蒸干后无残渣（或极少残渣）
再依次用2-2.5倍体积5%NaOH水溶液、1倍体积的蒸馏水、2-2.5倍体积的10%醋酸水溶液洗脱
最后用蒸馏水洗脱至pH中性，备用。
5%NaOH水溶液洗脱时，洗至NaOH水溶液颜色极淡为止。
有时因某些鞣质与聚酰胺的不可逆吸附，用NaOH水溶液很难洗脱
可用5%NaOH在柱中浸泡，每天将柱中的NaOH水溶液放出一次，并加入新的5%NaOH水溶液
这样浸泡一周后，鞣质可基本洗脱完。
然后用蒸馏水洗脱至pH8-9
再用2倍量的10%醋酸水溶液洗脱，
最后蒸馏水洗脱至pH中性，重复使用。
3、操作过程
3.1 装柱：
一般将颗粒状聚酰胺混悬于水中，使其充分膨胀
然后装柱，让聚酰胺自由沉降；
注：当用非极性溶剂系统时候，则用组分中低极性的溶剂装柱。
3.2 上样：
稀释适当浓度上样
一般每100ml聚酰胺上样1.5-2.5g，
样品先用洗脱溶剂溶解，浓度为20%-30%。
水溶性化合物直接上样；
若提取物水溶性不好，则用挥发性有机溶媒溶解、拌适量聚酰胺、挥干或减压蒸干、干法装入柱顶。
3、水洗：先用水洗脱。
4、醇洗：在水中递增乙醇浓度至浓乙醇溶液，或氯仿、氯仿-甲醇，递增甲醇至纯甲醇洗脱。若仍有物质未被洗脱，可用稀氨水或稀甲酰胺溶液洗脱，分段收集。
5、找到最佳吸附比：先小量试验找到最佳吸附比
6、放大：根据小试及最佳吸附比进行放大试验。
7、聚酰胺的回收：使用过的聚酰胺一般用5%氢氧化钠溶液洗涤，然后水洗，再用10%醋酸液洗，然后用蒸馏水洗至中性，即可。
黄酮类化合物的分离
对于分离黄酮类化合物来说，聚酰胺是较理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中的羟基数目与位置。一般有以下规律：
1、苷元相同，连接糖越多，吸附力越大，流出越慢。2、母核上增加羟基，洗脱速度相应减缓。3、对位、间位酚羟基使吸附能力 〉邻位酚羟基。4、不同类型的黄酮的流出顺序一般是：异黄酮 〉二氢黄酮醇〉黄酮 〉黄酮醇。5、分子中芳香核、共轭双键多者则吸附力强，晚出柱。6、若形成分子内氢键则吸附力减弱。
聚酰胺柱层析的溶剂洗脱系统
含水溶剂系统
甲醇-水（4：1）
乙醇-水（2：1）甲醇-乙酸-水（90：5：5 ）
非水溶剂系统
氯仿-甲醇（94：6）
苯-甲醇（3：1/7：3）
含水系统洗脱能力：碱液>甲醇>水
溶剂洗脱能力与溶剂极性相关可使化合物得到较好的分离。
选择系统时，可以将样品加入上述溶剂系统中，观察样品在聚酰胺薄膜的层析行为，然后确定溶剂系统。
黄酮苷元
氯仿-甲醇（94:6/96:4）
氯仿-甲醇-丁酮（12:2:1）
苯-甲醇-丁酮（90:6:4/84:8:8）
氯仿-甲醇-甲酸（60:38:2）
氯仿-甲醇-吡啶（70:22:8）
氯仿-甲醇-甲酸（60:38:2）
黄酮苷
甲醇-醋酸-水（90：5：5）
甲酸-水（4：1）；乙醇（4:1）丙酮-水（1:1）；异丙醇-水（3:2）30-60%醋酸；氯仿-甲醇-丁酮（64：25；10）乙酸乙酯-95%乙醇（6:4）氯仿-甲醇（7:3）；正丁醇-乙醇-水（1：4:5）
酚类
丙酮-水（1：1）苯-甲醇-醋酸（45：8:4） ；环己烷-醋酸（93：7） ；10%醋酸
醌类
丙酮-水（1：1） ；正己烷-苯-醋酸（45:8:4） ；石油醚-苯-醋酸（10：10：5）
糖类
丙酮-水（1：1）苯-甲醇-醋酸（45：8:4） ；环己烷-醋酸（93：7） ；10%醋酸
氨基酸衍生物
苯-乙醇（8：2/9：1）；50%醋酸；甲酸-水（1.5：100/1:1）乙酸乙酯-甲醇-醋酸（20：1：1）；0.05mol/L磷酸钠-乙醇（3：1）
生物碱
环己烷-乙酸乙酯-正丙醇-二甲基胺（30：2.5：0.9：0.1） ；
水-乙醇-二甲基胺（88：12：0.1）
甾体、萜类
己烷-丙酮（4：1）；氯仿-丙酮（4：1）
甾体苷
甲醇-水-甲酸（60：35：5）；
乙酸乙酯-甲醇-水-甲酸（50:20:25：5）
聚酰胺与大孔树脂的区别
吸附原理不同：大孔树脂是物理吸附原理；聚酰胺是化学吸附原理，氢键吸附，用于酚类、黄酮类、醌类成分的分离。
大孔树脂的分离效果没有聚酰胺好。若是粗粉可以用大孔树脂进行分段，聚酰胺可用于黄酮类成分的细分或纯化。
聚酰胺树脂可以使用其干柱层析功能，在分离黄酮的过程中作用也是很大的，而大孔树脂则没有此功能。
聚酰胺树脂可以首先用聚酰胺薄膜展开系统，而大孔树脂没有薄层
树脂进行新药研发，其新药若用大孔树脂制备，必须有打孔的残留检查，而聚酰胺目前还没有正式的文件要检查其残留
聚酰胺上样时，其样品中的鞣质会对主子产生死吸附，大孔出现这种现象很少
大孔的可选择类型比聚酰胺多，而且还增加了许多键合类型，如ASD型，其键合了酰胺键，增加了其选择性。
聚酰胺柱层析的不足：
比如机械强度不大，
粒度不均匀，分离时流速较慢
一些小分子杂质混入的问题
采用的解决方案有：
1.装柱前先过筛
2.装柱时用5%甲醇或10%盐酸预先除去小分子杂质
3.与硅藻土混合制粒以增加机械强度。